Pablo Bermejo-Álvarez, Julieta G Hamze, Beatriz Galiano-Cogolludo, Emel Tüten Sevím, Ismael lamas-toranzo, Priscila Ramos-Ibeas, Alba Pérez-Gómez
El genotipado masivo de la raza frisona ha dado lugar a la identificación de haplotipos deletéreos que nunca se observan en homocigosis en animales nacidos. Entre estos haplotipos letales, el Haplotipo Holstein 3 (HH3) consiste en una mutación puntual no sinónima (T/C) dentro del exón 24 del gen SMC2 (Structural Maintenance of Chromosomes 2).
Desafortunadamente, se desconoce el periodo del desarrollo en el que mueren los embriones dobles portadores (DP, homocigotos para HH3 que no expresan la proteína SMC2).
Conocer el momento en el que los embriones DP mueren es crítico para evaluar las pérdidas económicas asociadas al cruce inadvertido entre portadores (P, heterocigotos) y estimar el balance coste-beneficio del genotipado de terneras para identificar portadoras de HH3.
El impacto económico de la pérdida de gestación varía en gran medida entre pérdidas tempranas antes del reconocimiento materno de la gestación –que resultan en pérdidas similares a una inseminación no fecundante- a abortos tardíos que generan pérdidas mucho mayores. Para resolver esta cuestión hemos llevado a cabo una serie de experimentos in vivo e in vitro.
En un primer experimento, hemos analizado el desarrollo de conceptos de día 14 recogidos de 4 vacas portadoras superovuladas e inseminadas con un toro portador. Los conceptos se recogieron mediante lavado uterino, se fijaron en una solución de paraformaldehido al 4 % y se analizaron mediante inmunohistoquímica (IHC) para detectar los tres linajes presentes en ese estadio: trofoectodermo (CDX2+), hipoblasto (GATA6+) y epiblasto (SOX2+). Tras la adquisición de imágenes de fluorescencia, los conceptos fueron genotipados por PCR. Se observó una herencia mendeliana del haplotipo en los 17 conceptos recogidos (6:9:2 para no portadores (NP):P:DP). Todos los conceptos recogidos mostraron migración completa del hipoblasto, pero los conceptos DP presentaban forma esférica (no tubular) y un tamaño significativamente inferior (14.0±4.1 vs. 5.6±2.6 vs. 0.4±0.0 mm para NP, P y DP, respectivamente, media±e.e.m., t-test p<0.05). Además, ninguno de los conceptos DP presentó disco embrionario ni células del epiblasto, mientras que la mayoría de los NP y P contenían disco embrionario (6/6 para NP, 9/10 para P). Para determinar la capacidad de desarrollo de los embriones DP en estadios más tempranos, generamos embriones nulos para el gen SMC2 (knock-out, KO, funcionalmente equivalentes a DP) mediante la tecnología CRISPR.
Para ello denudamos ovocitos madurados in vitro y los dividimos en dos grupos: uno fue microinyectado con ARNm codificante para Cas9 y ARN guía (grupo C+G, compuesto parcialmente por embriones KO) y otro fue microinyectado sólo con ARNm codificante para Cas9 (grupo C, control de inyección compuesto únicamente por embriones NP). Los ovocitos microinyectados fueron fecundados in vitro y los cigotos cultivados en medio SOF hasta el día 8 post-fecundación, fijando los blastocistos resultantes para para detector mediante IHC las células del trofoectodermo (CDX2+) y la masa celular interna (SOX2+). Tras la IHC y la adquisición de imágenes, los embriones del grupo C+G fueron genotipados mediante miSeq para identificar los embriones KO (contienen únicamente alelos que no generan la proteína) y editados en marco (contienen al menos un alelo que no altera el marco de lectura y podría generar proteína funcional).
No se observaron diferencias significativas en las tasas de blastocistos entre los dos grupos microinyectados (35.9±3.6 vs. 27.4±3.8 %, media±e.e.m, para los grupos C y C+G, respectivamente, ttest p>0.05). Todos los embriones analizados en el grupo C+G (39) contenían alelos editados y 9 únicamente contenían alelos KO (funcionalmente equivalentes a DP). El análisis mediante IHC se llevó a cabo en 21 embriones NP (grupo C), 20 editados en marco y 9 KO. El número de células totales (DAPI+) y del trofoectodermo (CDX2+) fue significativamente más bajo en embriones KO comparados con NP o editados en marco (Total: 112.8±11.8 vs. 85.3±7.8 vs. 48.1±2.8; CDX2+: 90.4±11 vs. 62.8±6.9 vs. 32.3±1.6, para NP, editados en marco y KO, respectivamente, ANOVA p<0.05).
Un último experimento empleó la misma aproximación de edición génica aplicando un sistema de cultivo embrionario capaz de desarrollar blastocistos de día 7 hasta el día 12 post-fecundación. En este sistema, las tasas de supervivencia de día 7 a día 12 fueron más bajas en el grupo C+G (15/41) comparado con el grupo C (14/19). Los 41 embriones vivos y muertos en el grupo C+G fueron genotipados mediante miSeq, observando que todos los embriones KO (9) habían muerto, mientras que 15 de los 32 editados en marco sobrevivieron hasta día 12. En conclusión, los embriones DP paraHH3 muestran un retraso en el desarrollo en el estadio de blastocisto y no sobreviven a la elongación temprana del concepto, muriendo antes del reconocimiento materno de la gestación. Financiado por los proyectos PID2020-117501RB-I00 del MINECO y StG-757886 del ERC.
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